Il numero magico: 6

Ho letto un interessante articolo di Chris Burgess su Pharmaceutical Technology Europe di Giugno 2014 che potete trovare cliccando qui.

Perché a noi analisti piace tanto il numero 6? Perché eseguiamo 6 ripetizioni quando, in una validazione di un metodo, dobbiamo verificare la precisione di un metodo? Oppure perché ci viene chiesto di eseguire almeno altre 5 prove per verificare un outlier?

L'articolo da una spiegazione a questa pratica, che effettivamente ha un suo fondamento statistico.

Non sto a dilungarmi molto, potete leggere l'articolo al link sopra indicato.

Però volevo riportarvi la spiegazione  di come variano gli intervalli di confidenza di una media al variare del numero di dati a disposizione, considerato che questo è il caso più diffuso.

L'intervallo di confidenza di una media viene calcolato, considerando la distribuzione t, nel seguente modo:

Posta la deviazione standard uguale a 1 (s=1), una media pari a 0 (con un valore diverso il grafico sarebbe identico solo shiftato) e alfa pari a 0.05 (95% di probabilità, valore più diffusamente utilizzato), è possibile costruire un grafico dove in ascissa c'è n ed in ordinate l'intervallo di confidenza:

Da questo grafico è possibile osservare che con un numero di prove pari a 6 l'intervallo di confidenza della media diventerebbe:

con un intervallo di confidenza ampio 2s.

Con 18 ripetizioni invece si avrebbe:

cioè un'ampiezza pari a s.

In pratica per dimezzare l'ampiezza dell'intervallo di confidenza (da 2s a s) occorrerebbe triplicare il numero di prove (da 6 a 18)!!!
Variando il valore di s, l'intervallo viene amplificato o ridotto ma il rapporto tra i due punti non varia (provare per credere!!!).

Il numero 6 quindi costituisce un buon compromesso utilizzato anche dalle linee guida ICH Q2R1.

Ma il numero 6 è magico anche per verificare l'intervallo di confidenza della deviazione standard.

Ricordando che questa segue la distribuzione del chi quadro, vi lascio alla lettura dell'articolo per una spiegazione molto simile.

Buona lettura!!!

Modifiche permesse dalle farmacopee in cromatografia liquida

PARAMETRI	Ph Eur.		USP
	ISOCRATICA	GRADIENTE
pH nella fase mobile	± 0.2 dove non diversamente prescritto, o ± 1.0 quando vengono esaminate sostanze non ionizzabili	Variazioni non permesse	± 0.2
Concentrazione di sale nel tampone	± 10%	Variazioni non permesse	± 10% (se il pH rimane nel range sopra indicato)
Rapporto dei componenti nell’eluente	La quantità del componente minore può essere aggiustata del ±30% relativo o 2% in assoluto (quello tra i due più grande).	===	Per il componente minore: ± 30% relativo ma non deve superare il 10% in assoluto (riferito alla fase mobile totale).
Lunghezza d’onda (detector UV-Vis)	Variazioni non permesse	Variazioni non permesse	Variazioni non permesse (l’accuratezza della lunghezza d’onda deve essere ± 3 nm
Lunghezza colonna	± 70%	± 70%	± 70%
Diametro interno	± 25% Se le condizioni della colonna sono variate, il flusso può essere aggiustato utilizzando la formula sotto (vedi flusso)	± 25% Se le condizioni della colonna sono variate, il flusso può essere aggiustato utilizzando la formula sotto (vedi flusso)	Può essere aggiustato solo se la velocità lineare viene mantenuta costante (vedere flusso)
Dimensione particelle fase stazionaria	Può essere ridotta fino al 50%. Non può essere aumentata	Variazioni non permesse	Può essere ridotta fino al 50%. Non può essere aumentata
Fase stazionaria	Nessuna modifica permessa	Variazioni non permesse	===
Flusso	± 50% modifiche maggiori sono accettabili se rispettano la formula	modifiche sono accettabili se rispettano la formula	Se le condizioni della colonna sono cambiate il flusso può essere aggiustato usando la seguente formula: Il flusso può essere modificato del ± 50%
Volume di iniezione	Può essere ridotto se la precisione e i limiti di rivelabilità sono mantenuti. Non può essere aumentato	Può essere ridotto se la precisione e i limiti di rivelabilità sono mantenuti. Non può essere aumentato	Può essere ridotto se la precisione e i limiti di rivelabilità sono mantenuti. Non può essere aumentato
Temperatura colonna	± 10%		± 10%

La statistica dei campionamenti per attributi

Elenco i post relativi alla statistica dei campionamenti per attributi, in ordine logico:

Campionamento in accettazione per attributi - 1 - Introduzione
Campionamento in accettazione per attributi - 2 - Curve operative di tipo B
Campionamento in accettazione per attributi - 3 - Curve operative di tipo A
Campionamento in accettazione per attributi - 4 - Variazione in base a "n" e "c"
Campionamento in accettazione per attributi - 5 - Caratterizzazione di una curva

Riferimenti:

"Quality Control and Industrial Statistics", Acheson J. Duncan

Campionamento in accettazione per attributi - 5

Caratterizzazione di un piano di campionamento in accettazione
Malgrado la storia di un piano sia raccontata da una curva operativa completa, spesso l'interesse è puntato su alcune parti della curva: spesso si vorrebbe sapere, per es., quale dovrebbe essere la qualità del prodotto/processo (p') che condurrà ad una alta probabilità di accettazione dei lotti. 
Il produttore soprattutto sarà interessato a conoscere questo valore in modo da sapere quale deve essere il suo target per una alta percentuale di lotti accettati dal cliente.
In questo senso hanno interesse in particolare due punti, 0.95 e 0.90, cioè la probabilità di accettare il 95% o il 99% dei lotti e di conseguenza la qualità del prodotto a cui corrisponderanno questi valori, e cioè p'0.95 e p'0.99. In pratica si concentrerà sul suo rischio di vedersi rifiutati lotti conformi.
Al contrario il cliente sarà interessato a quale qualità del lotto (p'0.10 e p'0.05) corrispondono basse probabilità di accettazione (10% e 5%), cioè si focalizzerà sul rischio di accettare lotti non conformi.

Quando un cliente stabilisce un piano di campionamento per una fornitura continua di materiale, fa riferimento al LIVELLO DI QUALITA' ACCETTABILE (AQL, Acceptable Quality Level) che corrisponde al livello più povero di qualità  (o la massima frazione di difettosi) che è disposto ad accettare, con una probabilità per es. del 95% o del 90%. 
L'AQL è legato alle caratteristiche del processo del fornitore e non del piano di campionamento usato dal cliente.
E' importante sottolineare che il valore AQL non dà indicazione della qualità del prodotto e non costituisce il target del produttore. E' solo un parametro standard che il cliente utilizzerà per giudicare il prodotto. In teoria la qualità del prodotto p' deve essere ben al di sotto di AQL se il fornitore vuole che la maggior parte dei lotti siano accettati.
In pratica se AQL è 2% e alfa (rischio fornitore) di 0.05 (5%), verranno accettati il 95% (1-alfa) dei lotti con una difettosità pari o inferiore al 2%.


Il cliente è inoltre interessato al rischio di accettare frequentemente lotti che abbiano una difettosità maggiore di un certo limite: per es. non vuole accettare più del 10% di lotti che abbiano una difettosità maggiore o uguale al 8%. Questo livello è chiamato LTPD, Lot Tolerance Percent Defective.

Per disegnare una curva operativa occorrono questi due punti:
- p'1 (AQL) percentuale di difettosità massima tollerata e (1-alfa) probabilità di accettazione dei lotti con qualità pari o migliore di AQL
- p'2 (difettosità non accettata, LTPD) e beta, probabilità di accettazione di lotti con difettosità pari o maggiore di p'2


Esempio chiarificatore
Un cliente vuole un piano di campionamento che permetta di non accettare, per più del 10% delle volte (lotti), materiale con difettosità uguale o maggiore del 8%. Inoltre si stabilisce che il fornitore fornisca materiale che abbia al massimo 1% di difettosità ed il piano deve prevedere che questi lotti debbano essere accettati per almeno il 95% delle volte.
Il piano quindi dovrà passare da questi due punti

• p'1=0.01 (1%) e alfa=0.05 (5%)
• p'2=0.08 (8%) e beta=0.1 (10%)

Trovare il piano significa trovare i parametri n, d e c affinché la curva passi da questi due punti.

A questo link trovate un semplice file excel che vi permetterà di provare a cercare la curva che meglio approssimi i due punti, variando i valori di n e c.

Post precedente: Campionamento in accettazione per attributi - 4

Riferimenti:

"Quality Control and Industrial Statistics", Acheson J. Duncan

Prelevare un campione da un lotto: cosa posso trovare

Supponiamo di avere un lotto di 10 pezzi contenente 3 pezzi difettosi:

Ora decidiamo di prelevare 2 unità (n, numerosità del prelievo).

1. Qual è la probabilità di campionare unità tutte conformi?
   La probabilità di prelevare la prima unità conforme è 0.7 (7/10), la probabilità di prelevare la seconda ancora conforme è 0.6667 (6/9, le unità conformi rimaste sono 6 su 9 rimaste totali). La probabilità di trovarle entrambe conformi è P1=0.7*0.6667=0.4667
2. Qual è la probabilità di campionare 1 unità conformi e 1 difettosa?
   La probabilità di prelevare la prima unità conforme è 0.7 (7/10), la probabilità di prelevare la seconda non conforme è 0.3333 (3/9, tre unità non conformi su 9 unità rimaste). Quindi la probabilità di prelevare la prima conforme e la seconda difettosa sarebbe pa=0.7*0.3333=0.23331
   Però la stessa situazione potrei averla se prelevassi la prima unità non conforme e la seconda OK. In questo caso la probabilità di prelevare la prima difettosa è 0.3 (3/10) mentre quella di prelevare la seconda conforme sarebbe 0.7778 (7/9, 7 conformi su 9 rimaste). Quindi la probabilità di prelevare la prima difettosa e la seconda conforme è pb=0.3*0.7778=0.23334
   Quindi alla fine, la probabilità di ottenere una unità conforme e una difettosa, in qualsiasi ordine le abbia prelevate sarebbe P2=pa+pb=0.23331+0.23334=0.4667
3. Qual è la probabilità di campionare tutte unità difettose?
   La probabilità di campionare la prima unità difettosa è 0.3 (3/10), la probabilità di campionare anche la seconda difettosa è 0.2222 (2/9. 2 difettose rimaste su 9 unità totali rimaste). Quindi la probabilità di prelevare due unità e trovarle entrambe difettose è P3=0.3*0.2222=0.067

Se abbiamo considerato tutti i casi possibili, la somma delle probabilità P1, P2 e P3 deve essere 1:
infatti 0.4667 + 0.4667 + 0.0667 = 1.0001 (il fatto che sia leggermente superiore a 1 è dovuto agli arrotondamenti intermedi effettuati).

Supponiamo che il lotto sia molto grande, di 1000 pezzi, e che contenga sempre 3 unità di difettosi e di conseguenza 997 unità conformi.
Ora prendiamo il quesito 1:
la probabilità di estrarre la prima unità conforme è 0.997 (997/1000).
La probabilità di estrarre la seconda unità è 0.997 (cioè 996/999, cioè 996 unità conformi su 999 unità totali rimaste).
Ora prendiamo il quesito 3:
la probabilità di estrarre la prima unità non conforme è 0.003 (3/1000).
La probabilità di estrarre la seconda unità non conforme è 0.002 (2/1000)
Come si può facilmente intuire quindi, quando i lotti sono molto grandi rispetto alla numerosità del campionamento, la probabilità di estrazione di una unità conforme o difettosa, non varia a seconda che sia la prima o la seconda estratta.
Possiamo quindi dire in generale che la probabilità di estrarre una unità conforme è 0.997 (997/1000, 1-p) e quella di estrarre una unità difettosa è 0.003 (3/1000, p).

Revisionato il capitolo 6 Quality Control delle GMP

E' stato revisionato il capitolo 6 delle GMP relativo al Quality Control. 
Entrerà in vigore il 1 ottobre 2014.

Le modifiche sono le seguenti:

Punti	Versione in vigore	Versione in vigore dal prossimo 10/2014
6.5	"Control laboratory premises and equipment should meet the general and specific requirements for Quality Control areas given in Chapter 3."	"Control laboratory premises and equipment should meet the general and specific requirements for Quality Control areas given in Chapter 3. Labortatory equipment should not be routinely moved between high risk areas to avoid accidental cross-contamination. In particular, the microbiological laboratory should be arranged so as to minimize risk of cross-contamination."
6.7	Sono stati eliminati o modificati i seguenti punti: - sampling procedures; - testing procedures and records (including test worksheets and/or laboratory notebooks) - analytical reports and/or certificates;- data from environmental monitoring, where required; - procedures for and records of the calibration of instruments and maintenance of equipment	Tra i punti deila documentazione che deve essere disponibile nel Controllo Qualità sono stati introdotti: - Procedures describing sampling, testing, records (including test worksheets and/or laboratory notebooks), recording and verifying; - Procedures for and records of the calibrations/qualification of instruments and maintenance of equipment; - A procedure for the investigation of Out of Specification and Out of Trend results; - Testing reports and/or certificates of analysis; - Data from environmental (air, water and other utilities) monitoring, where required;
6.8	"Any Quality Control documentation relating to a batch record should be retained for one year after the expiry date of the batch and at least 5 years after the certification referred to in Article 51(3) of Directive 2001/83/EC"	"Any Quality Control documentation relating to a batch record should be retained following the principles given in chapter 4 on retention of batch documentation"
6.9	"For some kind of data (e.g analytical tests results, yields, environmental controls) it is recommended that records are kept in a manner permitting trend evaluation."	"Some kinds of data (e.g. tests results, yields, environmental controls) should be recorded in a manner permitting trend evaluation. Any out of trend or out of specification data should be addressed and subject to investigation".
6.12	"Reference samples should be representative of the batch of materials of products form which they are taken. Other samples may also be taken to monitor the most stressed part of a process (e.g. beginning or end of a process)."	"Samples should be representative of the batch of materials of products form which they are taken. Other samples may also be taken to monitor the most stressed part of a process (e.g. beginning or end of a process). The sampling plan used should be appropriately justify and based on a risk management approach."
6.13	"Sample containers should bear a label indicating the contents, with the batch number, the date of sampling and the containers from which samples have been drawn."	"Sample containers should bear a label indicating the contents, with the batch number, the date of sampling and the containers from which samples have been drawn. They should be managed in a manner to minimize the risk of mix-up and to protect the samples from adverse storage conditions."
6.15	"Analytical methods should be validated. All testing operations described in the marketing authorisation should be carried out according to the approved methods."	"Testing methods should be validated. A laboratory that is using a testing method and which did not performed the original validation, should verify the appropriateness of the testing method. All testing operations described in the marketing authorisation should be carried out according to the approved methods."
6.16	"The results obtained should be recorded and checked to make sure that they are consistent with each other. Any calculations should be critically examined."	"The results obtained should be recorded. Results of parameters identified as quality attribute of as critical should be trended and checked to make sure that they are consistent with each other. Any calculations should be critically examined."
6.17	Non è cambiato	E' stato aggiunto, alla lista delle informazioni da registrare, anche il riferimento allo strumento utilizzato per l'analisi
6.19	"Special attention should be given to the quality of laboratory reagents, volumetric glassware and solutions, reference standards and culture media. They should be prepared in accordance with written procedures."	"Special attention should be given to the quality of laboratory reagents, solutions, glassware, reference standards and culture media. They should be prepared iand controlled in accordance with written procedures. The level of controls should be commensurate to their use and to the available stability data."
6.20 (new)	paragrafo che non c'era	"Reference standards should be estabilshed as suitable for their intended use. Their qualification and certification as such should be clearly stated and documented. Whenever compendial reference standards from an official recognised source exist, these should prefereably be used as primary reference standards unless fully justified (the use of secondary standards is permitted once their traceability to primary standards has been demonstrated adn is documented). These compendial materials should be used for the purpose described in the appropiate monograph unless otherwise authorised by the National Competent Authority".
6.20 (old) 6.21 (new)	"Laboratory reagents intended for prolonged use should be marked with the preparation date and the signature of the person who prepared them. The expiry date of unstable reagents and culture media should be indicated on the label, together with specific storage condition. In addition, for volumetric solutions, the last date of standardisation and the last current factor should be indicated."	"Laboratory reagents, solutions, reference standards and culture media should be marked with the preparation and opening date and the signature of the person who prepared them. The expiry date of reagents and culture media should be indicated on the label, together with specific storage condition. In addition, for volumetric solutions, the last date of standardisation and the last current factor should be indicated."
6.23 (new)	paragrafo che non c'era	"Culture media should be prepared in accordance with the media manufacturer's requirements unless scientifically justified. The performance of all culture media should be verified prior to use".
6.24 (new)	paragrafo che non c'era	"Used microbiological media and strains should be decontaminated accordin to a standard procedure and disposed of in a manner to prevent the cross-contamination and retention of residues. The in-use shelf life of microbiological media should be established, documented and scientifically justified."
6.32 (old) 6.35 (new)	"Out of specification or significant atypical trends shoud be investigated. Any confirmed out of specification result, or significant negative trend, should be reported to the relevant competent authorities. The possible impact on batches on the market should be considered in accordance with chapter 8 of GMP Guide and in consultation with the relevant competent authorities."	"Out of specification or significant atypical trends shoud be investigated. Any confirmed out of specification result, or significant negative trend, affecting product batches released on the market should be reported to the relevant competent authorities. The possible impact on batches on the market should be considered in accordance with chapter 8 of GMP Guide and in consultation with the relevant competent authorities."
	Le parti che seguono non erano inserite nella versione del 2005	Technical transfer of testing methods
6.37 (new)	===	"Prior to transferring a test method, the transferring site should verify that the test method(s) comply with those as described in the Marketing Authorisation or the relevant technical dossier. The original validation of the test method(s) should be reviewed to ensure compliance with current ICH/VICH requirements. A gap analysis should be  performed, prior to commencing the technical transfer process."
6.38 (new)	===	"The transfer of testing methods from one laboratory (transferring laboratory) to another laboratory (receiving laboratory) should be described in a detailed protocol."
6.39 (new)	===	"The transfer protocol should include, but not be limited to, the following parameters: i. Identification of the testing to be performed and the relevant test method(s) undergoing transfer; ii. Identification of the additional training requirements; iii. Identification of standards and samples to be tested; iv. identification of any special transport and storage conditions of test items; v. The acceptance criteria which should be based upon the current validation study of the methodology and with respect to ICH/VICH requirement
6.40 (new)	===	"Deviations from the protocol should be investigated prior to closure of the technical transfer process. The technical transfer report should document the comparative outcome of the process and should identify areas requiring further test method revalidation, if applicable"
6.41 (new)	===	"Where appropriate, specific requirements described in others European Guidelines, should be addressed for the transfer of particular testing methods (e.g. Near Infrared Spectroscopy)"

E' stata posta ancora l'attenzione sul fatto che i metodo non solo devono essere validati, ma che qualsiasi modifica al metodo validato deve essere verificata.

E' stata ampliata la parte riguardante il trattamento dei reagenti/standard, ribadendo che va comunque gestita la preparazione, la scadenza e la validità all'apertura, lo stoccaggio, ecc.

E' chiaro come il concetto di Out of Trend sia entrato ormai a far parte della routine di laboratorio e debba essere tenuto in considerazione. La questione era già stata accennata nella versione del 2005 del capitolo ma ora è stata ulteriormente sottolineata.

Eventuali dati fuori trend devono quindi essere oggetto di indagine, magari meno impegnativa rispetto un OOS ma comunque tenuti in osservazione. 

Infine è stato introdotto il capitolo dell'analytical transfer che non era presente nella precedente (e ancora attuale fino a settembre) edizione del capitolo 6 (Quality Control) del volume 4 delle GMP.

Scusate la lunghezza del post, ma le modifiche erano tante!!!

Aggiornamento del 14/11/14
Vi consiglio anche il post "Update to EU GMP chapter 6 - Quality Control" del blog Inspired Pharma che commenta in modo più ironico le modifiche introdotte!

Campionamento in accettazione per attributi - 4

Variazioni delle curve operative con "n" e "c"

Un piano di campionamento che discrimina perfettamente tra lotti buoni e lotti cattivi deve avere una forma a zeta: correre orizzontalmente alla probabilità di accettazione = 1 fino a che p' sia tale da verificare l'equazione p'*n=c quindi dovrebbe crollare verticalmente e per valori più alti di p', mantenersi orizzontale ad una probabilità di accettazione pari a 0:

in questo modo , tutti i lotti con p' minore o uguale alla frazione difettosa massima permessa sono accettati, mentre quelli con p' maggiore sono rigettati. Un programma di campionamento di questo tipo permette di discriminare perfettamente i lotti buoni da quelli con difettosità maggiore di quella tollerata.

Sfortunatamente la forma a Z può essere ottenuta solo con l'ispezione del 100% di unità!!!

Si può ottenere una curva che approssimi la forma Z aumentando la dimensione del campione, vedasi per esempio le due curve sotto mostrate (notare che è aumentato anche c per mantenere la proporzione n/c):

In questo modo si è aumentata la precisione del piano di campionamento di discriminare tra lotti buoni e "cattivi".

Ovviamente però sono aumentati anche i controlli da effettuare!!!

La dimensione ottimale del campione (n) è sempre un compromesso tra una buona precisione ed un costo contenuto di analisi.

Mantenendo invece il valore n costante e variando il valore c si ottengono le seguenti curve:

All'aumentare di c (numero di accettazione) i piani di campionamento diventano sempre più "lassi" con l'effetto di aumentare la curvatura.

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Riferimenti:

"Quality Control and Industrial Statistics ", Acheson J. Duncan